تهیه رنگ متیلن بلوی بافری (گسترش مستقیم) Nairs BufferedMethylene blue stain Direct smear در روش رنگ آمیزی متیلن بلو فقط مورفولوژی (شکل ظاهری ) باکتری ها مشخص می شود و باکتری ها یک رنگ دیده می شوند. این روش آماده سازی گسترش مستقیم جهت مشخص نمودن جزئیات هسته تروفوزوئیتها و افتراق آنها از ماکروفاژها به کار می رود. به ویژه زمانی که از محلول با PH پائین استفاده شود که سبب نفوذ هر چه بیشتر رنگ به داخل ارگانیسم می گردد. به این رنگ آمیزی ساده گفته می شود چون یک نوع رنگ در این رنگ آمیزی استفاده می شود.از این نوع رنگ آمیزی می توان به رنگ آمیزی متیلن بلو به روش لوفلر اشاره نمود . متیلن بلو متیلن بلو روش رنگ آمیزی ساده متیلن بلو: ابتدا باید یک گسترش از باکتری مورد نظر تهیه کنیم پس از طی کردن مراحل مربوط به تهیه گسترش لام ، چند قطره از محلول رنگی متیلن بلو را روی گسترش ریخته و می گذاریم رنگ به مدت یک دقیقه با گسترش واکنش دهد . بعد گستره رنگ شده را با پنس گرفته و لام را بحالت مورب نگه می داریم تا باقی مانده رنگ ها به داخل تشتک یا ظرف رنگ آمیزی بریزد . در همین حالت رنگهای اضافی را با آب مقطر می شوییم. لام را به آرامی با کاغذ خشک کن پاک می کنیم تا آب آن گرفته شود . هیچگاه کاغذ خشک کن را روی گستره نمی کشیم زیرا باعث پاک شدن یا از بین رفتن گسترش می شود.بعد از 5 تا 10 دقیقه سیتوپلاسم به رنگ آبی کمرنگ . و هسته به رنگ آبی بسیار پر رنگ دیده می شود. گسترشها باید در مدت 30 دقیقه مورد بررسی قرار گیرند. دقت کنید در طی این مدت رنگ آمیزی ، رنگ روی گسترش نباید خشک شود چون در این حالت رنگ خشک شده متبلور شده و سطح باکتری را می پوشاند و آنرا غیر قابل دیدن می کند . جهت جلوگیری از این حالت تبلور باید از مقدار کافی محلول رنگی استفاده کرده و بعد از خالی کردن آن ، سطح لام را بلافاصله شست . طرز تهیه محلول رنگی متیلن بلو 5 /0%: metilen-blue کلرور آبی متیلن بلو5/0گرم + آب مقطر 100سی سی آبی متیلن را در آب مقطر حل کنید. جهت بررسی گسترش با عدسی : جهت بررسی گسترش متیلن بلو ابتدا با عدسی با بزرگنمایی کم ( 10× ) تمام قسمتهای گسترش (لامل ) رابررسی می کنیم. اگر مورد مشکوکی مشاهده شد از عدسی با بزرگنمایی ( 40× ) برای بررسی جزئیات استفاده می نماییم . حتی در مواردی که مورد مشکوکی مشاهده نگردید ، حداقل یک سوم لامل باید با عدسی با بزرگنمایی ( 40× ) مورد بررسی مجدد قرار گیرد . معمولا” تک سلولی ها نور را منعکس می کنند . چون این گونه ارگانیسم ها کمرنگ می باشند ، می توانند نور را ازخود عبور دهند و مشاهده آنها مشکل گردد. بنابراین باید با نور کم، گسترش ها را بررسی نمود .زمانیکه نور زیاد باشد بیشتر ارگانیسمها به خوبی مشاهده نمی شوند . نکته : استفاده از محلول لوگلی که در رنگ آمیزی باکتریها استفاده می شود، به دلیل غلظت آن جهت رنگ آمیزی انگل ها توصیه نمی گردد . چنانچه در بررسی گسترش ، حرکت تروفوزوئیت کم شده باشد، می توان با قرار دادن یک سکه کوچک گرم شده در کنار گسترش ، حرکت آن را تحریک نمود . همچنین با فشار روی لامل نیز می توان باعث حرکت مایع و تحریک تروفوزوئیت جهت حرکت نمودن گردید.