تست های مولکولی تشخیصی کووید-۱۹ (COVID-19) (ویرایش ۱، ۱۶/۱۲/۹۸)

چندین نوع کرونا ویروس می ­توانند انسان را آلوده کنند. تعدادی از آنها منجر به بیماری خفیف می­ شوند، در حالیکه برخی نظیر MERS-CoV و SARS-CoV مرگ و میر بالایی دارند. در دسامبر سال ۲۰۱۹، گروهی از بیماران مبتلا به کروناویروس جدید (novel coronavirus, 2019 nCoV) در ووهان، چین مشخص شدند. این ویروس توسط کمیته بین ­المللی طبقه­ بندی ویروس ها، SARS-CoV-2  نامگذاری شده است. در این متن از این ویروس با عنوان کووید-۱۹ (COVID-19) نام برده می ­شود که نام ترجیحی سازمان بهداشت جهانی است.

هدف
هدف از این مطب ارائه راهنمایی به آزمایشگاه های تشخیص مولکولی و ذی­نفعان در رابطه با تست های مولکولی ویروس COVID-19  است.
 
ایمنی زیستی (BioSafety)
کار با نمونه برای آزمایش های مولکولی نظیر تعیین توالی یا تست تقویت اسید نوکلئیک (Nucleic Acid Amplification Tests, NAAT) نیاز به امکانات BSL-2 یا معادل آن دارد. تلاش برای کشت ویروس یا تست های خنثی­ سازی حداقل به امکانات BSL-3 نیاز دارند.
باید از ضد عفونی کننده ­های مناسب با فعالیت اثبات شده در برابر ویروس ­های پاکت ­­دار (enveloped) استفاده شود. به عنوان مثال: هیپوکلریت، الکل، پراکسید هیدروژن، و ترکیبات فنلی.
نمونه ­های موارد مشکوک یا تأیید شده باید به عنوان UN3373(مواد بیولوژیک طبقه B ) و نمونه­ های کشت ویروسی باید به عنوان گروهA ، UN2814 (ماده عفونی، با تأثیر بر انسان) در نظر گرفته شوند.
 
نوع نمونه مناسب برای تستهای مولکولی
جدول شماره ۱ نوع نمونه و زمان نمونه ­برداری را به تفکیک شرایط فرد (بیمار یا فرد در تماس) نشان می­دهد.
 

جدول شماره ۱. نوع نمونه مناسب برای تست های مولکولی کووید-۱۹

سواب توصیه­ شده، سواب داکرون یا پلی­استر است.

 
بسته­بندی و حمل و نقل نمونه­های بالینی
نمونه ­ها باید در اسرع وقت پس از جمع آوری به آزمایشگاه برسند. نمونه ­هایی که سریعاً به آزمایشگاه تحویل داده می­ شوند را می ­توان در دمای ۸-۲ درجه سانتی گراد نگه داری و ارسال کرد. هرگاه احتمال تاخیر در ارسال نمونه وجود داشته باشد، استفاده از محیط انتقالی ویروسی (viral transport medium, VTM) حاوی مکمل های ضد قارچ و آنتی ­بیوتیک قویا توصیه می ­شود. چنانچه VTM در دسترس نباشد، ممکن است بتوان از سالین استریل استفاده کرد. نمونه ­ها را می­توان در ۲۰- درجه سانتی گراد یا به طور ایده ­آل در ۷۰- درجه سانتی گراد منجمد کرده و روی یخ خشک حمل نمود. اهمیت دارد که که از انجماد و ذوب مکرر نمونه ­ها خودداری شود.
 
تست های تقویت اسید نوکلئیک  )NAAT  ( برای ویروس کووید-۱۹
تأیید تشخیص بیماران مبتلا بر اساس شناسایی توالی ژن های منحصر به فرد ویروس با روش های NAAT مانند واکنش زنجیره پلیمراز معکوس در زمان واقعی  )real-time reverse (transcriptase polymerase chain reaction, rRT-PCR است که می ­تواند با تعیین توالی (sequencing) تایید نهایی شود. اسید نوکلئیک مورد استفاده RNA است و ژن های ویروسی که تاکنون با این روش ها مورد هدف قرار گرفته­ اند شامل ژن هایN ،E ،S  و RdRP هستند. به زبان ساده، شناسایی نواحی مختص کووید-۱۹ در این ژن ها بیانگر آلودگی فرد با کووید-۱۹ است. شکل شماره ۱، قرارگیری این ژن ها در کنار یکدیگر را نشان می­ دهد. ژنوم بالایی مربوط به کووید-۱۹ و ژنوم پایینی مربوط به ویروس SARS ‌است.
 

شکل شماره ۱. قرارگیری ژن های ویروس کووید-۱۹ (نوار آبی بالایی) و تشابه آن با ژن های ویروس SARS (نوار آبی پایینی). شکل مربوط به بیمارستان Charité برلین می ­باشد. همانگونه که مشاهده می ­شود، در این روش محل قرارگیری پرایمرهای واکنش زنجیره پلیمراز روی ژن های E (برای غربالگری اولیه) و RdRp (برای تایید نهایی) است.

 
در حال حاضر، چندین پروتوکل مبتنی بر NAAT‌ برای شناسایی کووید-۱۹ معرفی شده ­اند. برخی از آن ها در خود آزمایشگاه ها توسعه یافته­ اند (in-house) و پروتوکل آنها منتشر شده است. برخی نیز به طور تجاری (commercial) در دسترس هستند. جدول شماره ۲ روش های موجود را نشان می ­دهد. پروتوکل مربوط به این روش ها و اطلاعات تماس با ایجادکننده ­های آن ها در سایت سازمان بهداشت جهانی در دسترس است. شایان ذکر است که سازمان بهداشت جهانی تاکید دارد که هیچ یک از این روش ها در حال حاضر مورد ترجیح این سازمان نبوده و هیچ کدام از روش ها توسط این سازمان مورد اعتبارسنجی (validation) قرار نگرفته ­اند.
 

جدول شماره ۲. خلاصه پروتوکل های موجود از تست های مولکولی مبتنی بر NAAT

 
تفسیر نتیجه مثبت تست های تقویت اسید نوکلئیک  (NAAT(
در مناطقی که کووید-۱۹ انتشار دارد، یک نتیجه مثبت به روش rRT-PCR برای تایید تشخیص کافی است.
 
تفسیر نتیجه منفی تست های تقویت اسید نوکلئیک  )NAAT(
در مناطقی که کووید-۱۹ انتشار دارد، یک یا چند نتیجه منفی احتمال عفونت با کووید-۱۹ را رد نمی­کند. تعدادی از مهمترین عواملی که می­توانند منجر به نتیجه منفی در یک فرد آلوده شوند، به این شرح هستند:

• کیفیت پایین یا مقدار اندک نمونه. برای بررسی کیفیت اسید نوکلئیک توصیه می­ شود که یک ژن انسانی به طور همزمان به عنوان کنترل روی نمونه تست شود.
• جمع­ آوری نمونه خیلی زود یا خیلی دیر در سیر بیماری
• نگه داری یا حمل و نقل نادرست نمونه
• دلایل فنی مانند جهش های ویروسی یا مهارکننده ­های  PCR

در صورتی که نتیجه منفی از بیمار مبتلا با شک بالینی قوی به عفونت با ویروس به دست آید، به ویژه هنگامی که فقط نمونه ­های دستگاه تنفسی فوقانی جمع ­آوری شده باشند، باید نمونه ­های اضافی از جمله از دستگاه تنفسی تحتانی در صورت امکان جمع ­آوری و آزمایش شوند.

توالی ­یابی ژنوم ویروس (viral sequencing)
علاوه بر تأیید حضور ویروس با روش NAAT، تعیین توالی درصدی از نمونه­ ها در دوره ­های منظم می ­تواند برای پایش از جهت ایجاد جهش های تازه در ژنوم ویروسی مفید باشد. این موضوع از این جهت حائز اهمیت است که ایجاد جهش های تازه ممکن است روی عملکردهای متقابل پزشکی از جمله کارایی تست های تشخیصی و نیز سیر مطالعات اپیدمیولوژیک مولکولی اثر بگذارند.

منبع
رهنمودهای سازمان بهداشت جهانی (https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019/technical-guidance/laboratory-guidance)

ترجمه و تلخیص: گروه علمی پاتولوژی مولکولی و سیتوژنتیک انجمن علمی آسیب شناسی ایران