سیستم های تشخیصی مبتنی بر PCR و اهمیت آن در شناسایی بیماری کرونا

PCR روش تکنیکی است که برای تکثیر بخشی از DNA مورد¬ نظر یا تولید نسخه¬های بسیار زیاد به کار می¬رود. به عبارت دیگر، PCR به ما امکان می¬دهد میلیون¬ها نسخه از یک توالی DNA خاص را از یک نمونه کوچک، در بعضی مواقع حتی یک نسخه، تهیه کنیم.

به گزارش ایفدانا به نقل از روابط عمومی معاونت غذا و دارو دانشگاه ایران در همه­ گیری اخیر بیماری کرونا، متخصصان بهداشت عمومی بر آزمایش، ردیابی افراد آلوده و ردیابی ارتباطات آنها به عنوان یک استراتژی موثر برای کاهش شیوع ویروس تأکید کرده­اند. چندین روش تشخیصی برای شناسایی ویروس کرونا در آزمایشگاه­های بالینی، تحقیقاتی و بهداشت عمومی گزارش شده است.

برخی از آزمایشات با شناسایی RNA ویروسی و سایر آزمایشات بطور مستقیم با شناسایی آنتی­بادی­های میزبان، عفونت را تشخیص می­دهند. یک آزمایش تشخیصی در طی همه­گیری باید به تصمیم­گیری بالینی مناسب در مدت زمان کوتاه کمک کند. روش­های تشخیصی که اخیرا جهت شناسایی بیماری Covid-۱۹ گزارش شده­اند برحسب توان­های عملیاتی مختلف، عملکردهای تحلیلی، زیرساخت­های مورد نیاز و مدت زمات جوابدهی، تفاوت­های عمده­ای را دارا می­باشند. با درنظر گرفتن این عوامل، امروزه روش RT-PCR به عنوان پرکاربردترین روش تشخیص مستقیم بیماری کرونا استفاده می­گردد. در این مقاله، ما به صورت مختصر روش PCR را توضیح می­دهیم و به صورت اختصاصی با جمع­بندی گزارش­های علمی بیان شده در مقالات علمی معتبر و سازمان­های نظارتی مربوطه، به مزایای روش RT-PCR در شناسایی بیماری Covid-۱۹ می­پردازیم. در نهایت، درباره­ی محدودیت­های روش بیان شده، بحث می­کنیم و دیدگاه محققین در مورد آزمون­ها و تست­هایی که در آینده نزدیک، جایگزین­های معتبرتر و سریعتر در شناسایی بیماری کرونا می­شوند را اشاره­ای خواهیم نمود.

کلمات کلیدی: واکنش زنجیره­ای پلیمراز (PCR)، دستگاه Thermo Cycler ، بیماری Covid-۱۹ ،  DNA، RT-PCR

بخش ۱: مقدمه

تکنیک PCR اولین بار در سال ۱۹۸۵ توسط دانشمندی به نام کری مولیس ابداع شد. اهمیت این روش از آن جا آشکار می­شود که این دانشمند به علت ابداع این روش در سال ۱۹۹۳ جایزه نوبل شیمی را از آن خود کرد. PCR خلاصه­ای از یک روش ساده اما بسیار مفید در زیست شناسی مولکولی به نام واکنش زنجیره ای پلیمراز است. این روش تکنیکی است که برای تکثیر بخشی از DNA مورد­ نظر یا تولید نسخه­های بسیار زیاد به کار می­رود. به عبارت دیگر، PCR به ما امکان می­دهد میلیون­ها نسخه از یک توالی DNA خاص را از یک نمونه کوچک، در بعضی مواقع حتی یک نسخه، تهیه کنیم. این یک فرآیند حیاتی برای طیف وسیعی از فناوری­های ژنتیکی است و در حقیقت، توسعه مجموعه­ای از فناوری­های جدید را امکان­پذیر کرده است.

PCR آنچه در هسته­ی سلول­ها هنگام کپی شدن (تکثیر) قبل از تقسیم سلولی اتفاق می­افتد را تقلید می­کند، اما در شرایط کنترل شده در آزمایشگاه انجام می­شود. دستگاهی که مورد استفاده قرار می­گیرد دستگاه PCR یا ترموسایکلر نامیده می­شود. لوله­های آزمایش حاوی مخلوط DNA مورد نظر در دستگاه قرار می­گیرند و دستگاه دما را متناسب با هر مرحله از فرآیند تغییر می­دهد. برای انجام آزمایشPCR ، نمونه استخراج شده که شامل الگوی DNA هدف است به یک لوله حاوی آغازگرها، نوکلئوتیدهای آزاد (dNTPs) و Taq پلیمراز اضافه می‌شود. مخلوط واکنش PCR در دستگاه ترموسایکلر قرار می‌گیرد. دستگاه ترموسایکلر در طی مراحل اتوماتیک و برنامه ریزی شده، دمای مخلوط PCR را افزایش و کاهش می‌دهد که در نهایت به صورت تصاعدی نسخه‌های توالی‌های هدف را تکثیر می‌کند
.

 PCR در طی سیکل­های متوالی انجام می­پذیرد که هر سیکل شامل سه مرحله است:

مرحله اول: Denaturation

هنگام تکثیر DNA ، دو رشته مارپیچ دوگانه DNA باید جدا شوند. جداسازی با افزایش دمای مخلوط اتفاق می­افتد و باعث می­شود پیوندهای هیدروژن بین رشته­های مکمل DNA شکسته شود. به این فرآیند دناتوراسیون گفته می­شود.

این مرحله در درجه حرارت ۹۳ تا ۹۵ درجه سانتی­گراد صورت می­پذیرد.

مرحله دوم: Annealing

در این مرحله آغازگرها (Primer) به DNA الگو هیبرید می­شوند. آغازگر­ها، مولکول­های DNA تک زنجیره­ای کوتاه هستند که به دو انتهای توالی DNA در منطقه مورد نظر متصل می­شوند. در این مرحله درجه حرارت واکنش کاهش می­یابد. (دمای ۵۰ تا ۵۶ درجه سانتیگراد)

مرحله سوم: Extension

رشته های جدید DNA با استفاده از رشته­های اصلی به عنوان الگو ساخته می­شوند. DNA پلی­مراز پروتئینی است که بر روی DNA تک رشته حرکت می­کند و با استفاده از نوکلئوتیدهای آزاد، هر نوکلئوتید را در مقابل نوکلئوتید مکمل خود قرار می­دهد. این امر غالبا به کمک آنزیم Taq polymerase صورت می­گیرد، آنزیمی که در اصل از باکتری گرمادوست به نام Thermus aquaticus جدا شده است. ترتیب اضافه شدن نوکلئوتیدهای آزاد با توالی نوکلئوتیدها در رشته DNA (الگو) اصلی تعیین می­شود. فعالیت این آنزیم در دمای ۷۲ درجه سانتی­گراد صورت می­پذیرد.

نتیجه یک چرخه PCR دو توالی دو رشته ای DNA هدف است که هر یک حاوی یک رشته تازه ساخته شده و یک رشته اصلی است. این چرخه بارها تکرار می شود (معمولاً ۲۰-۳۰) زیرا بیشتر فرآیندهای استفاده از PCR به مقدار زیادی DNA احتیاج دارند. فقط ۲ تا ۳ ساعت طول می کشد تا یک میلیارد نسخه از آن تهیه شوند.

در شکل ۱ فرآیند واکنش زنجیره­ای پلیمراز به نمایش گذاشته شده است.

شکل۱. فرآیند واکنش زنجیره­ای پلیمراز [۱]

یکی از انواع PCR، RT-PCR (PCR معکوس) می­باشد. این نوع واکنش ترکیبی از وارونویسی (Reverse Transcription) و PCR است که باعث ازدیاد توالی مورد نظر از الگوی RNA می­شود. توالی مورد نظر در قطعات DNA که محصول PCR هستند، تظاهر پیدا می­کند. حساسیت این روش به مراتب بیشتر از انتقال RNA و هیبرید کردن با پروب نشان دار است. حساسیت RT-PCR باعث شده است که بتوان mRNA های بسیار کمیاب و mRNA های حاصل از تعداد اندک سلول با مقادیر ناچیز بافت را تشخیص داد. از دیگر انواع PCR می­توان به PCR لانه­ای و ARMS-PCR اشاره کرد.

اولین بار از PCR برای تکثیر قطعه ای از DNA رمزگردان بتاگلوبین انسان برای تشخیص کم خونی داسی شکل در جنین استفاده شد. امروزه کاربردهای مختلفی از PCR در تشخیص بیماری ها صورت می­گیرد. امروزه به کمک PCR می­توان قطعه هدف DNA را به طور اختصاصی تغییر داد. علاوه بر ان به کمک پرایمرهای مناسب می­توان به طور مشخص، نوکلئوتیدهایی را در محصول PCR وارد یا حذف نمود و یا جایگزین نوکلئوتیدهای قبلی نمود. امروزه از مهمترین کاربرد PCR می­توان به شناسایی بیماری Covid-۱۹ اشاره نمود. درادامه به صورت مفصل در این مورد صحبت خواهد شد.

جهت تقویت بخش­های DNA از طریق واکنش زنجیره­ای پلیمراز و یا تسهیل سایر واکنش­های حساس و تشخیص سریع از دستگاهی به نام چرخاننده دما یا به اصطلاح Thermo Cycler استفاده می­شود. این دستگاه دارای یک بلوک حرارتی با چاهک­هایی است که می­توان Micro Tube های مخلوط واکنش را در آن قرار داد. سپس این دستگاه در مراحل مجزا و از قبل برنامه ریزی شده، دمای بلوک را متناسب با مرحله مد نظر بالا و پایین می ­آورد.

معمولا یک واکنش PCR نیاز به DNA الگو، دو عدد پرایمر، چهار نوع دی اکسی نوکلئوتیدتری فسفات (dNTP)، غلظت مشخصی از بافر منیزیم کلراید (MgCl۲) و نوعی از آنزیم DNA پلیمراز مقاوم به حرارت (مشخصا Taq پلیمراز) دارد. اقلام فوق را در یک ویال کوچک (Micro Tube) ریخته و در داخل چرخاننده دما قرار می­دهند. چرخاننده دما معمولا دارای چندین برنامه است که توسط اپراتور قابل تغییر می­باشد. به طور کلی یک برنامه شامل چندین سیکل می­باشد. یک سیکل معمولا شامل چند مرحله است.

1. حرارت دادن نمونه در دمای حدود ۹۵ درجه سانتی گراد برای چند دقیقه تا DNA الگو دناتوره شود.م
2. پایین آوردن دما به حدود ۶۵-۵۰ درجه سانتی گراد بین ۳۰ ثانیه تا ۳ دقیقه، تا پرایمرها به DNA الگو متصل شوند.
3. حرارت دادن در دمای ۷۲ درجه بین ۳۰ ثانیه تا ۳ دقیقه برای ساخته شدت رشته­های جدید.
4. معمولا یک واکنش PCR دارای ۲۵ تا ۴۰ سیکل می­باشد. کل زمان واکنش بسته به دستگاه مورد استفاده متفاوت می­باشد و تحت سیستم حرارتی و برودتی دستگاه قرار دارد.

سیستم مرسوم حرارتی و برودتی مورد استفاده در چرخاننده­های دما، استفاده از بلوک حرارتی با روش ترموالکتریک (Peltier effect) می­باشد. بلوک­ها دارای چاهک­هایی هستند که قابلیت تطبیق با ویال­های مختلف را دارند. به این ویال­ها میکروسانتریفیوژ تیوب نیز می­گویند. بعضی از بلوک­ها قابلیت جای دادن پلیت­های ۹۶ چاهکی را نیز دارند. اپراتور می­تواند برنامه­های مورد نظر خود را با دما­ها و زمان­های دلخواه وارد دستگاه کند. افزایش یا کاهش دمای بلوک تا دمای وارد شده در برنامه را Ramping می­نامند و معمولا به میزان ۱ الی ۳ درجه سانتی­گراد در ثانیه صورت می­گیرد. اخیرا چرخاننده­های حرارتی جدیدی ساخته شده­اند که به آن­ها Capillary air thermal cycler می­گویند. یک حباب هالوژنی (به جای بلوک فلزی)، اطاقک پر شده با مواد را حرارت می­دهد و یک دریچه که با جریان الکتریکی فعال می­شود، مسئول سرد کردن ویال­ها است. اطاقک دارای یک فن می­باشد که جریان هوا را در آن برقرار می­کند.

در شکل ۲ نمونه­ای از دستگاه چرخاننده دما را مشاهده می­نمایید.

شکل ۲- نمونه­ای از دستگاه چرخاننده دما (PCR) [۲]

بخش ۲: نقش حیاتی PCR در شناسایی بیماری کووید

بیماری همه­گیر ویروس کرونا (COVID-۱۹) و تلاش­های انجام شده برای مهار این بیماری، یک بحران بهداشتی در سراسر جهان ایجاد کرده است که تمام بخش­های زندگی انسان را تحت تأثیر قرار می­دهد. با پیشرفت تدریجی زمان، COVID-۱۹ به عنوان یک پاندمی توسط سازمان بهداشت جهانی (WHO) اعلام شد که دارای یک پتانسیل بسیار خطرناک برای تأثیرگذاری بر میلیون­ها زندگی در همه کشورها، به ویژه در کشورهای دارای سیستم بهداشتی ضعیف تر است. این ویروس به دو دلیل اساسی کشنده است. اولاً، این ویروس جدید است و هیچ واکسنی برایش کشف نشده است، و ثانیاً، از طریق تماس مستقیم یا غیر مستقیم با فرد مبتلا به راحتی منتقل می­شود.

برای افزودن به آمارهای وحشتناک این بیماری، ایالات متحده آمریکا که یکی از پرچمداران پیشرو در پیشرفت بهداشت و درمان است، بیشترین تعداد قربانیان COVID-۱۹ را ثبت کرده است. پس از آن کشورهای برزیل ، هند ، روسیه ، آفریقای جنوبی قرار دارند و این لیست برای ۲۱۵ کشور در سراسر جهان ادامه دارد. تعداد موارد جدیدی که هر روز گزارش می­شود با سرعت بیشتری در حال افزایش است و دولت­ها و مقامات عالی کشورها را در سراسر جهان مجبور می­کند قرتطینه را برای اطمینان از فاصله اجتماعی برای مهار بیماری تحمیل کنند.

چندین روش تشخیصی برای شناسایی ویروس کرونا در آزمایشگاه­های بالینی، تحقیقاتی و بهداشت عمومی استفاده شده است. آزمایشات مستقیم با شناسایی RNA ویروس، عفونت را مستقیماً تشخیص می­دهند، در حالی که آزمایشات غیرمستقیم آنتی­بادی­های ضد ویروس را در میزبانی که در معرض بیماری است اندازه گیری می­کنند. یک روش آزمایش تشخیصی باید از حساسیت و دقت کافی برخوردار باشد تا تصمیمات بالینی مناسب را به سرعت در طی یک بیماری همه گیر اتخاذ کند.

Real Time PCR پرکاربردترین روش برای تشخیص مستقیم SARS-CoV-۲ است. از روش ایمونواسی برای اندازه­گیری آنتی­بادی علیه SARS-CoV-۲ استفاده می­شود. روش­های نوظهور با استفاده از CRISPR  نیز جهت شناسایی بیماری کووید گزارش داده شده است. جدا از روش­های آزمایشگاهی RT-PCR و ایمونواسی، در چند ماه گذشته چندین روش ازجمله POC و تست­های Rapid در دسترس قرار گرفته است. روش­های اصلی تشخیص در شکل۳ نمایش داده شده است.

شکل۳- روش­های تشخیصی موجود جهت شناسایی بیماری کووید [۳]

سازمان­های نظارتی مانند سازمان بهداشت جهانی (WHO) و سازمان غذا و داروی ایالات متحده (FDA) استفاده از تعدادی از روش­های تشخیصی را تأیید کرده­اند، در حالی که برخی از روش­های جدید تحت مجوز استفاده اضطراری (EUA) تأیید مشروط را دریافت می­کنند[۴].

بسته به تجهیزات و روش مورد استفاده، نتیجه آزمایشات انجام شده وابسته به پروتکل جمع­آوری نمونه­، معرف­های استفاده شده، پتانسیل آلودگی متقابل و نیازهای ذخیره سازی نمونه و معرف می­باشد. این عوامل باید در هنگام انتخاب روش تشخیصی مطمئن و سریع، در نظر گرفته شود تا به تصمیم گیری مناسب و اقدامات سریع بهداشت عمومی کمک کند.

روش های تشخیص مولکولی شامل تجزیه و تحلیل اسیدهای نوکلئیک موجود در نمونه برای شناسایی ویروس است.  متداول­ترین روش تشخیص آزمایشگاهی برای تشخیص COVID-۱۹ ، روش RT-PCR است. جهت تشخيص و نظارت بر بيماري­هاي ويروسي مختلف از جمله SARS-CoV و MERS-CoV نيز از همين روش استفاده شده است. تعداد زیادی از پرایمرها و آغازگر­های تجاری مورد استفاده در RT-PCR برای تشخیص SARS-CoV-۲ وجود دارد. آزمایش RT-PCR بسته به نوع ورژن PCR کمتر از یک ساعت تا چند روز به نتیجه می­رسد. روش RT-PCR می­تواند در رویکردهای یک یا دو مرحله ای انجام شود. روش یک مرحله ای سریعتر است که در آن RT و DNA پلیمراز با هم ترکیب می­شوند تا واکنش مربوطه خود را در همان لوله واکنش انجام دهند و یک روش ترجیحی برای تشخیص SARS-CoV-۲ است. روش دو مرحله­ای شامل RT از RNA در یک لوله و پس از آن پلیمریزاسیون DNA در یک لوله واکنش جداگانه است. بسته به نوع سنجشی که صورت می­پذیرد، یک دستگاه RT-PCR می­تواند همزمان یک تا صدها نمونه را آزمایش کند. نتیجه آزمایش RT-PCR به جمع­آوری نمونه، پرایمرها و پروب­های مورد استفاده، تجزیه و تحلیل منحنی­های فلورسانس، استفاده از کنترل­های مناسب و تنظیمات کنترل دما بستگی دارد. برای بررسی آلودگی متقابل نمونه از کنترل منفی و برای ارزیابی یکپارچگی شیمیایی معرف ها، پرایمرها و پروب ها از کنترل مثبت استفاده می­شود. علاوه بر این کنترل ها، CDC ایالات متحده استفاده از کنترل نمونه انسانی (HSC) را برای اطمینان از لیز موفقیت آمیز و یکپارچگی معرف­های استخراج و به حداقل رساندن نتایج منفی کاذب با اطمینان از جمع­آوری کافی مواد سلولی انسانی توصیه می­کند [۵].

اگرچه روش PCR معکوس مزایای زیادی دارد، اما از معایب آن می­توان به هزینه­های بالای آزمایش معمولی RT-PCR و امکانات مورد نیاز جهت انجام این آزمایش از جمله دستگاه­های PCR اشاره کرد. از معایب دیگر می­توان زمان­بر بودن این آزمایش از لحظه نمونه برداری تا انتقال نمونه به آزمایشگاه مورد تایید و انجام آزمایش در آن محل اشاره نمود که چندین روز گاها زمان می­برد. علاوه بر این، مراحل آماده­سازی و سنجش نمونه به نیروی انسانی آموزش دیده نیاز دارد. این معایب استفاده گسترده تر از این فناوری را در طی همه­گیری ویروس کرونا محدود می­کند.  علاوه بر این، تقاضای زیاد در هنگام شیوع همه­گیری باعث کمبود سواب، تجهیزات محافظت شخصی، واکنشگرهای PCR و تجهیزاتی مانند ترموسایکلرها و کابینت های سطح ۲ ایمنی زیستی می­شود. از آنجایی که روش های RT-PCR مکان­های هدف خاص را تقویت می­کنند­، اگر منبع هدف خاص در نمونه وجود نداشته باشد، نتایج منفی گزارش می­شود. در طی بیماری همه­گیر COVID-۱۹ ، نگرانی فزاینده ای نیز در مورد غیرقابل دسترس بودن روش­های آزمایش مبتنی بر RNA و کمبود جهانی معرف وجود دارد[۶].

بخش ۳. چشم­انداز­های آینده:

در میان روش­های مختلف موجود برای تشخیص COVID-۱۹ ، RT-PCR مطمئن­ترین و پرکاربردترین روش است.  در موارد اضطراری همه گیری، کمبود منابع مانند کیت­های PCR معمول است. بنابراین داشتن چندین گزینه برای روش­های تشخیصی مهم است. روش­های RT-PCR که در حال حاضر انجام می­شود، هزینه بر است و بنابراین بسیاری از کشورها، به ویژه کشورهای کم درآمد، نمی­توانند تعداد کافی آزمایشات COVID-۱۹ را برای غربالگری جمعیت بیشتر انجام دهند. تضمین کیفیت و چارچوب­های نظارتی مربوط به آزمایش­های شناسایی کوووید همچنان یک چالش است. چندین مورد از فراخوانی کیت­های آزمایش COVID-۱۹ در چندین کشور به دلیل کیفیت مشکوک و پایین آن­ها گزارش شده است. فقدان یک استاندارد مرجع ثابت، استفاده از روش­های مختلف جمع آوری و آماده سازی نمونه، و درک ناقص از پویایی ویروسی در طول دوره عفونت، ارزیابی دقیق و دقت تشخیصی بسیاری از سنجشهای جدید SARS-CoV-۲ را مختل می­کند [۷].

تکنولوژی­های جدیدی مانند تشخیص­های مبتنی بر CRISPR یا RT-LAMP و گسترش پیشرفت تکنولوژی میکروفلویید­های کاغذی، امکان تشخیص سریع، راحت، ارزان، قابل حمل و مطمئن را فراهم نموده­اند. نمونه­ای از چنین سیستم­هایی برای تشخیص بیماری کووید، توسط Yang و همکارانش در مقاله [۸] آورده شده است. با توجه به این واقعیت که احتمال ابتلا به COVID-۱۹ مانند ویروس های آنفولانزا در جمعیت باقی خواهد ماند، یک روش آزمایش مالتی پلکس برای بیماری­های متعدد باید به عنوان یک آزمایش معمول آزمایش در آینده در نظر گرفته شود.

مراجع:

1. 
   
2. 
   
3. Giri, Basant, et al. "Review of analytical performance of COVID-۱۹ detection methods." Analytical and bioanalytical chemistry (۲۰۲۰): ۱-۱۴.
4. U.S. FDA. FAQs on emergency use authorizations [EUAs] for medical devices during the COVID-۱۹ pandemic. FDA. ۲۰۲۰.
5. CDC. CDC ۲۰۱۹-Novel coronavirus [۲۰۱۹-nCoV] real-time RT-PCR diagnostic panel https://www.fda.gov/media/۱۳۴۹۲۲/ download. Accessed ۲ July ۲۰۲۰.
6. Diao B,Wen K, Chen J, Liu Y, Yuan Z, Han C, et al. Diagnosis of acute respiratory syndrome coronavirus ۲ infection by detection of nucleocapsid protein. medRxiv. ۲۰۲۰
7. Cheng MP, Papenburg J, Desjardins M, Kanjilal S, Quach C, Libman M, et al. Diagnostic testing for severe acute respiratory syndrome–related coronavirus-۲: a narrative review. Ann Intern Med. ۲۰۲۰.
8. Yang T, Wang Y-C, Shen C-F, Cheng C-M. Point-of-care RNA-based diagnostic device for COVID-۱۹. Diagnostics. ۲۰۲۰;۱۰:۱۶۵.

محمد حسین مسعودی
کارشناس ارشد مهندسی پزشکی
دپارتمان مهندسی پزشکی، معاونت غذا و دارو
دانشگاه علوم پزشکی ایران